產(chǎn)品中心
PRODUCT CENTER
一步法抗體純化試劑盒
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Cat. No. |
Product Name |
Unit Size |
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EB101 |
BcMag? One-Step Antibody Purification Kit |
2 ml |
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EB102 |
BcMag? One-Step Antibody Purification Kit |
10 ml |
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簡介
BcMag? 一步式抗體純化試劑盒專為從人類、小鼠、大鼠、兔子、山羊、馬、豚鼠、豬、倉鼠和驢等血清中快速小規(guī)模高通量純化各種IgG種類而設(shè)計。與傳統(tǒng)的結(jié)合-洗滌-洗脫親和純化方法不同，BcMag? 一步法抗體純化試劑盒通過清除血清中大量存在的非相關(guān)蛋白質(zhì)，將抗體與血清分離。一步法抗體純化磁珠可以結(jié)合血清中的非抗體蛋白質(zhì)（如白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白），使抗體溶解在適和的緩沖液中通過磁珠，便于存儲和下游應(yīng)用。如果血清樣品未溶血，可以直接將其應(yīng)用到磁珠上，無需進行硫酸銨沉淀。
一步法抗體純化試劑盒解決了常用的將蛋白A和蛋白G固定在固相載體上的純化方法的缺點。使用蛋白A和蛋白G親和技術(shù)可以選擇性地結(jié)合IgG種類和亞類。這種技術(shù)通常非常耗時且繁瑣，需要采用極端的洗脫條件來破壞親和鏈接。純化后的抗體通常需要透析或去鹽處理后，才能存儲或用于下游應(yīng)用。一步法抗體純化技術(shù)不需要洗脫步驟，而是在生理pH下使用適中的純化緩沖液。此外，由于純化后的抗體處于不含伯胺基的緩沖液中，因此可以直接用于胺基反應(yīng)的結(jié)合化學(xué)反應(yīng)。
磁珠產(chǎn)品與傳統(tǒng)色譜法如純化柱、瓊脂糖或非磁性樹脂相比具有顯著優(yōu)勢。基于磁珠的特性可以在約20分鐘內(nèi)快速高產(chǎn)率處理96個樣品，不同IgG種類抗體純化產(chǎn)物獲得超過80％純度和超過90％回收率。當(dāng)使用基于色譜柱的技術(shù)實驗時，在科學(xué)研究實驗室處理多個樣品時，可能需要大量的手動移液操作。這種移液操作會造成實驗和人之間目標(biāo)生物分子產(chǎn)量的差異。實驗人員和學(xué)生可能需要大量的培訓(xùn)和實踐才能產(chǎn)生恒定的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。而且磁珠具有許多優(yōu)點，例如它們易于使用，快速的實驗方案，適用性以及高通量自動化和小型化處理的便利性等。
產(chǎn)品特點和優(yōu)勢：
? 高效 - 回收率超過90％，純度超過85％。
? 快速純化 - 一步法手動或一步法高通量操作。
? 便捷 -無需使用純化柱、過濾器，且不需要繁瑣的移液或離心操作。
? 不含胺基緩沖液 - 無需進行去除或中和操作。
? 結(jié)合力強 - 適用于對蛋白A或蛋白G結(jié)合能力較差的IgG亞類。
? 溫和 - 無需苛刻的抗體洗脫條件，有助于保持IgG的活性。
? 可再生 - 磁珠可重復(fù)使用，可進行多達(dá)3次純化。
工作流程（圖1）：
向血清中加入磁珠。
通過慢速上下移液25次（一分鐘）或旋轉(zhuǎn)混勻器混合樣品。
磁分離非抗體血清蛋白結(jié)合的磁珠，從而獲得純抗體。
將上清轉(zhuǎn)移到一個新的試管中。
操作步驟：
提示：
? 以下 操作方案為示例。磁珠和樣品體積可進行合理的放大或縮小。
? 每40μl磁珠可做用于3μl血清。磁珠用量少會產(chǎn)生雜質(zhì)。使用過多的磁珠可能會降低目標(biāo)抗體的產(chǎn)量。血清中的IgG水平通常為10-15mg/ml，但結(jié)果可能因物種和樣品制備而異。
? 使用磁珠純化后的樣品中可能存在轉(zhuǎn)鐵蛋白，包括小鼠和大鼠血清樣品。這些物種的轉(zhuǎn)鐵蛋白具有各種性質(zhì)，不會像其他物種的轉(zhuǎn)鐵蛋白那樣會和磁珠發(fā)生反應(yīng)。純化前，進行硫酸銨沉淀，可以降低轉(zhuǎn)鐵蛋白的存在。
儀器要求
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Item |
Source |
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磁力分離器
**根據(jù)樣品體積，用戶可以選擇以下磁力分離器之一 |
l BcMag? separator-2 適用于兩個單獨的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-01); l BcMag? separator-6 適用于六個單獨的1.5毫升離心管 (Bioclone, Cat.# MS-02); l BcMag? separator-24 適用于24個單獨的1.5-2.0 ml離心管 (Bioclone, Cat.# MS-03); l BcMag? separator-50 適用于1個單獨的50毫升離心管，1個單獨的15毫升離心管, 以及4個 1.5毫升 離心管 (Bioclone,Cat.# MS-04）
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BcMag 96孔磁力分離器 |
l BcMag 96-well Plate Magnetic Separator (side-pull,) 或者 96-well PCR plate 和 96-well microplate, 或其他兼容的磁力分離器(Blioclone, Cat#: MS-06) |
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可調(diào)單通道和多通道移液器 |
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擺斗離心機 |
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如果使用96孔PCR板/管，則需要添加項目 |
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渦懸混合器 **用戶還可以使用其他型號的渦懸混合器。但是，時間和速度應(yīng)進行優(yōu)化，并且混合器應(yīng)滿足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 轉(zhuǎn)速 ≥ 2000 rpm |
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Eppendorf? MixMate? |
Eppendorf, Cat#:5353000529 |
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Tube Holder PCR 96 |
Eppendorf, Cat#: 022674005 |
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Tube Holder 1.5/2.0 mL, for 24?×?1.5 mL or 2.0 mL |
Eppendorf, Cat#: 022674048 |
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Smart Mixer, Multi Shaker |
BenchTop Lab Systems, Cat#:5353000529 |
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1.5/2.0 mL 離心管 |
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96孔PCR板或者 8孔 PCR 管 |
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PCR 板/管 ** IMPORTANT! 如果使用其他管或PCR板，確保PCR管或PCR板錐形部分底部的井徑必須≥2.5毫米。 |
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如果使用96孔微孔板需要添加的設(shè)備 |
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Fisher Scientific? Microplate Advanced Vortex Mixers |
Fisher, Cat#:02-216-101 |
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OHAUS Microplate Vortex Mixers |
OHAUS, Cat#:30392160 |
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渦懸混合器 **用戶還可以使用其他型號的渦懸混合器。但是，時間和速度應(yīng)進行優(yōu)化，并且混合器應(yīng)滿足: 扭矩 ≥1.5 mm-4 mm, 轉(zhuǎn)速 ≥800 rpm |
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平底透明的非結(jié)合型分析微孔板 |
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實驗步驟
重要提示：
? 以下方案針對3μl血清樣品的高效純化進行的優(yōu)化。如果進行其他反應(yīng)，則可能需要進行程序優(yōu)化。
? 在使用前，搖晃或渦旋混合試劑瓶，完全重懸磁珠。
? 不要讓磁珠靜置超過兩分鐘。
1.將40μl磁珠轉(zhuǎn)移到新的96孔PCR板、96孔微孔板或0.2ml PCR管的孔中，并加入3μl血清。
2.通過緩慢上下移液25次（一分鐘）或旋轉(zhuǎn)混勻器以2000rpm的速度混合磁珠和樣品。
3.將樣品板/管放在磁力分離板上，靜置30秒至1分鐘，直至磁珠完全分離并沿管壁靠近板底部。期間，磁珠將被磁力架吸附到磁力架上，而上清液將保留在樣品管中。
4.使用多通道或單通道移液器，小心地從樣品板/管中取出上清液，避免吸取到磁珠。
5.將上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔PCR板、96孔微孔板或其他目標(biāo)容器中。至此，抗體已被高效純化。
請注意，以上步驟僅為示例，并假定您使用了Bioclone的BcMag? 一步式抗體純化試劑盒。實際操作時，請根據(jù)試劑盒的使用說明進行操作，并注意確保實驗操作在無菌環(huán)境下進行。
附加信息：
磁珠再生
1.如果必須再生磁珠，則需添加50μL 5M NaCl，并通過緩慢上下吹吸移液25次（1分鐘）或通過渦流混合器在2000 rpm下攪拌5分鐘，將磁珠與樣品混合。將樣品板/試管放在磁性分離板上30秒或直到溶液澄清。丟棄上清液。
2.重復(fù)步驟1五次。
3.用40μl 25mM MES，PH6.5重新懸浮磁珠，并在4°C下儲存。磁珠可以被再生三次而不會失去實質(zhì)上的選擇性。
問題與建議
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問題 |
可能原因 |
建議 |
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純化抗體的產(chǎn)量太低或檢測不到 |
樣品中抗體的含量太低 |
? 使用其他方法，如ELISA或同類型試劑盒，確保樣品含有IgG。 |
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樣品中抗體未與磁珠結(jié)合 |
? 確保樣品緩沖液中的 pH值在 6.5 - 7.0范圍內(nèi). |
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觀察到染色的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上存在多條條帶 |
樣品中含有大于25mM的鹽，同時pH值可能不是中性的。 |
? 使用低鹽中性緩沖液對樣品進行透析。 ? 確保樣品緩沖液中的 pH值在 6.5 - 7.0范圍內(nèi). |
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純化出大量抗體。然而，沒有發(fā)現(xiàn)目標(biāo)抗體 |
目標(biāo)抗體濃度太低 |
? 利用活性親和磁珠和特異性抗原純化抗體。 |
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純化的IgG被染色 |
對血清樣品進行溶血。 |
溶血的消除
以下操作可用于減少或消除血清樣品中的溶血。 ?在抗凝血劑存在的情況下采集血液并離心以去除紅細(xì)胞。
?謹(jǐn)慎采血，避免溶血。
?收集間質(zhì)液而不是血液。 |
